سنجش به روش فلوسیتومتری

 

 

 

فلوسیتومتری (به صورت مخخف FCM)  تکنیکی برای شمارش و بررسی ذرات میکروسوپی مانند کروموزم ها و سلول ها هست که با تعلیق آنها در یک جریان مایع و عبور دادن انها از مقابل یک دستگاه شناسایی الکترونیکی ، کار می کند .

 

فلوسیتومتری اجازه تجزیه و تحلیل هزار ذره را در هر ثانیه از  نظر چندین پارامتر فیزیک و یا شیمیایی را می دهد . این روش به طور معمول برای شناسایی ناهنجاری سلامتی به ویژه سرطان خون استفاده می شود اما این تکنیک استفاده گسترده دیگری هم در زمینه پژوهش و بالینی دارد . ویژگی مشترک ها این است که  ذرات را بر اساس خاصیت فیزیکی آنها دسته بندی می کنند و بدین صورت میتوانیم به جمعیت خالص خود دست یابیم .

 

              

نوعی فلوسیتومتر اولیه

 

 اولین دستگاه فلوسیتومتری بر اساس امپدانس با استفاده ازاصل کولتر در آمریکا رونمائی شد (حدود 1953 میلادی). اولین فلورسانس براساس دستگاه فلوسیتومتری در سال 1968 توسط ولفگانگ (Wolfgang Göhde) از دانشگاه مونستر و اولین استفاده تجاری از ان توسط یک شرکت آلمانی در سال های 1968/69 انجام گرفت . در آن زمان ، استفاده از روش های جذب به طور گسترده مورد علاقه دانشمندان بود و هنوز فلوسیتومتری رواج پیدا نکرده بود . بلافاصله بعد از آن ،تکنیک و ابزرات فلوسیتومتری گسترش یافتند . شامل تولید Cytofluorograph در سال 1971 ، Pas8000 در سال 1973 توسط شرکت Partec  ، اولین دستگاه FACS توسط شرکت  Becton Dickinson در سال 1974 و …

 

 

 

نام تکنولوژی فلوسیتومتری

 

نام اصلی تکنیک فلوسیتومتری "پالس سیتوفتومتری" (آلمانی : Impulszytophotometrie) بود . درست بیست و دو  سال پیش یعنی در سال 1988 ،در کنفراسن مجمع مهندسان آمریکا در شهر فلوریدا ، نام آن به "فلوسیتومتری " تغییر یافت و به این صورت گسترش یافت .

 

 

اصل فلوسیتومتری

 

باریکه ای از نور(معمولا نور لیزر) تنها از یک طول موج به جریان مایع هیدرودینامیکی فوکس شده تابانده می شود . تعدادی آشکارسازدر نقاطی که جریان از برابر باریکه نور عبور می کند تعبیه شده اند : یکی از آنها در یک خط با پرتو نور (اسکاتر فوروارد یا پیش برنده FSC) و تعدادی دیگرهم عمود بر آن (اسکاتر کناری SSC) قرار دارند همچنین تعدادی آشکار ساز فلورسنت هم در دستگاه تعبیه شده است . هر یک از ذرات معلق از 0.2 تا 150 میکرومتر از برابر پرتو لیزر عبور می کنند و نور را پراکنده می کنند و مواد شیمیایی فلورسنت در ذرات و یا متصل شده به ذرات تهیج میشوند و نوری با طول موج بالا نسبت به منبع ساطع می کنند ترکیب نور اسکترها و فلورسنت توسط دکتورها انجام میگرید این روش بررسی ساختمان فیزیکی و شیمیایی و همچنین کسب اطلاعات مختلف از هر گونه ذره را ممکن می سازد . FSC یا اسکاتر مقابل (فوروارد اسکتر) با اندازه سلول و SSC با پیچیدگی درونی ذره (مانند شکل هسته ، تعداد و شکل گرانول های داخل سیتوپلاسمی ، زبری غشا ) متناسب است . برخی از دستگاه های فلوسیتومتری در بازار نور فلورسنت را حذف کرده اند و تنها از نور اسکاتر ها استفاده می کنند .

 

 

فلوسیتومتر

 

فلوسیتومترهای امروزی قادرند تا هزار ذره را در یک ثانیه بررسی کنند که به انها "Real time" میگویند . این دستگاه ها میتوانند ذرات را بر اساس ویژگی های خاص ایزوله و آنالیز کنند . یک دستگاه فلوسیتومتری شبیه میکروسکوپ است به این تفاوت که به جای تولید یک تصویر از سلول ، دارای توانایی عملکردی بسیار بالا است و خودکار بر اساس پارامتر ها سلول ها را شمارش می کند . برای تجزیه و تحلیل بافت جامد باید سوسپانسیونی تک سلولی از بافت تهیه کنیم .

 

 

 

دستگاه فلوسیتومتری دارای 5 جزء اصلی است :

 

جریان سلولی (flow cell) : جریان مایع (مایع شیث)، که سلول های نمونه را حمل و صف بندی می کند تا یکی یکی از مقابل پرتو نور لیزر عبور کنند .

 

سیستم اندازه گیری : به طور معمول برای اندازه گیر امپدانس مورد استفاده قرار می گیرد .

 

سیستم نوری : لامپ (جیوه یا زنون) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت زیاد (لیزری که توسط سیستم ابی خنک می شوند) (آرگون ، کریپتون ، لیزر رنگی) ، لیزر خنک کننده آبی با قدرت کم (آرگون 488 نانومتر)، لیزر  قرمزHeNe (633 نانومتر) ، سبز HeNe، لیزر HeCd (اشعه ماورای بنفش UV)   ، لیزر دیودی (آبی ، سبز ، قرمز ، بنفش) جز سیستم نوری فلوسیتومترهستند که در سیگنال نوری تکنیک کاربرد دارند .

 

سیستم ADC (تبدیل کننده سیستم آنالوگ به دیجیتال) که سیگنال های نوری  اسکترهای جلو و پهلویی و همچنین سیگنال های فلورسنت را به سیگنال های الکترونیکی که قابل شناسایی با کامپیوتر هستند ،  تبدیل میکند .

 

 

رایانه برای آنالیز سیگنال ها 

 

فرایند  جمع آوری اطلاعات از نمونه در دستگاه فلوسیتومتر به مرحله "'Acquisition'" یا تحصیل معروف است . فرایند تحصیل به کمک رایانه ای انجام می گیرد که به طور فیزیکی به دستگاه وصل شده است و نرم افزاری که واسطه دیجیتالی بین کامپیوتر و کاربر است . این نرم افزار قابلیت تنظیم پارامترها بر اساس نوع نمونه را دارد (مانند ولتاژ ) . همچنین نرم افزار کمک می کند تا به اطلاعات اولیه نمونه دسترسی داشته باشیم و بدین وسیله از صحت تنظیم پارامترها اطلاع یابیم . دستگاه های فلوسیتومتری اولیه به طور کلی ، دستگاه های تجربی بودند اما پیشرفت های تکنیکی برنامه های کابردی وسیعی را ایجاد کرده است که در هر دو زمینه بالینی و پژوهشی به طور گسترده استفاده می شود . با توجه به این تحولات ، بازار ابزارت ، نرم افزارهای تجزیه و تحلیل وهمچنین ریجنت ها (معرف ها) مانند آنتی بادی های فلورسنت شده به طور چشم گیری گسترش یافته است .

 

 

 

اطلا عات جمع اوری شده توسط فلوسیتومتر را میتوان در بُعد واحدی و یا در دو بعد و یا حتی سه بعد برای تولید یک هیستوگرام رسم نمود . مناطقی از این هیستوگرام را میتوان به صورت مرتب بر اساس شدت فلورسنت از هم جدا کرد . این کار با استفاده از "واحد های استخراجی" انجام میگیرد که به آنها "گیت" می گیوند . پروتکل های اختصاصی Gatting برای شناسایی بیماری ها و همچنین اهداف کلینیک و آزمایشگاهی به خصوص در خون شناسی تعریف و ایجاد شده است .

 

رسم ها معمولا در مقیاس های لگارتیمی ساخته می شوند. از انجا که طیف رنگ های فلورسنت با هم ، همپوشانی دارند سیگنال ها در دتکتورها (آشکارسازها) باید از نظر الکتریکی و محاسباتی جدا شوند . داده های گردآوری شده با فلوسیتومتری توسط نرم افزار های مختلفی مانند WinMD (توصیه نمی شود) ، Flowjo ، Cell quest Pro بررسی می شوند . بعد از اینکه داده ها جمع آوری شدند دیگر نیاز به اتصال دستگاه فلوسیتومتری نیست . به همین دلیل است که بررسی ها معمولا در رایانه جداگانه ای انجام میگیرد . این کار به ویژه در مراکزی که با تقاضای بالا استفاده از دستگاه روبه رو هستند لازم است .

 

 

تجزیه و تحلیل محاسباتی | Computational analysis

 

پیشرفت های اخیر در شناسایی خودکار که بر اساس روشهای محاسباتی انجام میگرید ارئه کننده جایگزینی  برای استراژی های gate است . سیستم های خودکار شناسایی به طور بالقوه جمعیت های پنهان و نادر را شناسایی می کنند با ادامه مطلب در چند روز آینده همراه ما باشید .