سنجش به روش کروماتوگرافی HPLC

کروماتوگرافی لغتی یونانی به معنی رنگ نگاری است که ترکیبی از دو واژه “کروما” به معنی رنگ و “گروفین” به معنی نوشتن است. در سال ۱۹۰۳ برای اولین بار از این روش جداسازی مواد رنگی استفاده شد که این کار توسط میخائیل‌سوئت انجام گرفت. اما امروزه از این روش برای جداسازی مواد بی رنگ چون گازها استفاده می‌شود یکی از پرکاربردترین روش‌های جداسازی مواد در آزمایشگاه کروماتوگرافی است و در مواقعی که جداسازی به روش‌های دیگر ناممکن است به راحتی می‌توان از این روش استفاده کرد، زیرا اختلافات‌های جزئی موجود در رفتار اجسام باعث تسهیل جداسازی در جریان عبور آن‌ها از یک سیستم کروماتوگرافی می‌شود‌. این روش بسیار ساده و سریع است به طور مثال آزمایشی که ممکن است با استفاده از روش ستون تقطیر چندین روز به طول بینجامد، می‌تواند به کمک کروماتوگرافی در عرض زمانی بسیار کوتاه انجام گیرد، وسایل مورد لزوم آن نیز ارزان قیمت است.

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا ( (High Efficiency Liquid Cgromotography (HPLC ) بدون سؤال ، سریع‌ترین رشد را در بین تمام روش‌های جداسازی تجزیه‌ای با فروش سالیانه در گستره بیلیون دلار داشته است. دلایل این رشد انفجارآمیز عبارتند از حساسیت روش ، سازگاری سریع آن برای انجام اندازه‌گیری‌های کمی صحیح ، شایستگی آن برای جداسازی مواد گونه‌های غیرفرار یا ناپایدار در مقابل گرما و مهم‌تر از همه ، کاربرد گسترده آن برای موادی است که در صنعت ، زمینه‌های مختلفی علوم و جامعه اهمیت درجه اول را دارند.

تاریخچه:

پیش از دهه ۱۹۷۰ روشهای بسیار کم و غیر قابل اعتمادی جهت کروماتوگرافی در آزمایشگاههای دانشمندان وجود داشت.

در طول دهه ۱۹۷۰ بیشتر جداسازی مواد شیمیایی توسط روشهای متعددی انجام می شده که شامل کروماتوگرافی ستونی ، کروماتوگرافی کاغذی و کروماتوگرافی لایه نازک بوده است. بهر حال این تکنیکهای کروماتوگرافی جهت شناسایی و تعین غلظت بین مواد مشابه و یکسان کافی نبود.

در این حین استفاده از روش کروماتوگرافی مایع تحت فشار برای کاهش زمان جداسازی رواج پیدا کرد و کاهش زمان خالص سازی ترکیبات بروش روماتوگرافی ستونی انجام شد.به هر حال شدت جریان مایع درون این ستون ثابت و پایدار نبود و مدتها این سوال مطرح بوده که بهتر نیست این شدت جریان یا فشار ثابت باشد ؟

توسعه کروماتوگرافی مایع با فشار بالا در اواسط دهه ۱۹۷۰ انجام شد و پیشرفت و تکامل آن مقارن شد با تکامل مواد پک شده درون ستون کروماتوگرافی و همچنین ردیابهای اتوماتیکی که می توانستند بصورت آنلاین مقدار عبور مایع را محاسبه نمایند.

در اواخر دهه ۱۹۷۰ ، روشهای جدیدی شامل کروماتوگرافی مایع با فاز معکوس این امکان را فراهم کرد تا جداسازی ترکیبات بسیار مشابه ، عملی گردد. در دهه ۱۹۸۰ ، بطور رایجتری از HPLC  برای جداسازی ترکیبات شیمیایی استفاده می شده است.
تکنیکهای جدید روشهای جداسازی ، شناسایی ، خالص سازی و محاسبه مقدار را متفاوت از گذشته توسعه داد. همچنین برای تسهیل در کار HPLC  ، کامپیوتر و اتوماسیون به سایر روشها اضافه گردید.

به مرور تکامل انواع ستونها ، تولید ستونهای بسیار باریک ، ستونهای پیوسته باعث سرعت در کار HPLC  گردید. در دهه گذشته شاهد ظهور میکرو ستونها و ستونهای تخصصی شده برای  HPLC  بوده ایم. قطر معمول میکروستونها یا ستونهای مویی شکل ، حدود µm  ۳  تا   µm  ۲۰۰ دارد.

طول ستونهای HPLC سریع ،  کمتر از ستونهای HPLC  معمولی و برابر mm  ۳  است و در بخشهای بسیار کوچک در دستگاه HPLC  جاسازی می گردند. هر چند که امروزه HPLC مورد توجه تحقیقات بیوتکنولوژیکی ، شیمیایی و بیوشیمیایی و همچنین صنایع داروسازی است اما این موارد فقط   ۵۰ درصد  استفاده کنندگان HPLC  را نشان میدهد.در حال حاضر از HPLC در صنایع آرایشی ، غذایی ، تولید انرژی و صنایع زیست محیطی استفاده می شود

فاز متحرک:

عموما فاز متحرک حاوی مخلوطی از حلالهای قطبی نظیر الکل و غیر قطبی نظیرهیدروکربنها است. با کنترل ترکیب و قطبیت فاز متحرک در روش گرادیان حلال می توان زمان و حجم باز داری مواد را در ستون HPLC کنترل نمود.فاز متحرک در HPLC باید چنان انتخاب شود که در آشکار ساز مزاحمت ایجاد نکند . معمولا مخلوطهای متانول , اتانول یا پروپانول با هپتان و کلروفرم با هپتان را به عنوان فاز متحرک در HPLC مورد استفاده قرار می دهند. در HPLC فاز معکوس عموما از مخلوط متانول یا استونیتریل با آب به عنوان فاز متحرک استفاده می شود.

استفاده از نانوالماس‌ها در کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا :

پاول نسترنکو و همکارانش در دانشگاه ایالتی مسکو در روسیه توانستند با استفاد از نانوالماس‌‌ها به عنوان فاز ساکن در کروماتوگرافی مایع با کارآیی بالا (HPLC) مخلوطی از هیدروکربن‌های آروماتیک را به خوبی از هم جدا کنند.

یکی از چالش‌های موجود در کروماتوگرافی، توسعه ویژگی‌های ستون کروماتوگرافی برای انجام جداسازی بهتر و با انتخابگری بالاتر بوده است.

فازهای ساکن مختلفی مورد استفاده قرار گرفته‌اند، اما تنها معدودی از آنها نیازمندی‌های لازم را از جهت پایداری شیمیایی و مکانیکی را برآورده کرده‌اند.
الماس‌ها ماده ایده‌آلی برای پر کردن ستون می‌باشند، چرا که پایداری بسیار بالایی داشته و در نتیجه می‌توانند در دماها و فشارهای بالا و در حضور اسیدها و بازهای قوی، و حلال‌های آلی قوی مورد استفاده قرار بگیرند.

نسترنکو توضیح می‌دهد: «با این حال الماس طبیعی بسیار گران بوده و ذرات الماس مصنوعی کوچک‌تر از آنی هستند که در این ستون‌ها مورد استفاده قرار بگیرند».
برای حل مشکل هزینه و اندازه ذرات، نسترنکو یک فناوری پخت توسعه داده است که او را قادر می‌سازد نانوالماس‌های مناسب HPLC را به دست آورد. او از طریق پخت نانوالماس‌ها در فشار ۱۲۰۰۰ مگاپاسکال و دمای ۱۲۰۰ درجه سانتی‌گراد، ذرات الماس متخلخل چندبلوری را در ابعاد میکرومتری تولید کرد.

این مواد گروه جدید و جالبی از فازهای ساکن هستند، زیرا در عین حالی که ویژگی‌های اصلی الماس را حفظ کرده‌اند، برهمکنش‌های بسیار جالبی با ماده مورد تجزیه نشان می‌دهند

انواع کروماتوگرافی:

 کروماتوگرافی تقسیمی

 کروماتوگرافی تبادل یونی

 کروماتوگرافی جذب سطحی

 کروماتوگرافی طردی

کروماتوگرافی تقسیمی :

کروماتوگرافی تقسیمی در بین چهار نوع روش کروماتوگرافی مایع بیشتر از همه به کار برده شده است. در گذشته اکثر کاربردها به ترکیبات نایونی, قطبی با وزن مولکولی کم و یا متوسط معمولا کمتر از ۳۰۰۰ مربوط بوده است. ولی اخیرا روشهایی ابداع شده اند ( مشتق سازی و زوج یونی ) که جداسازیهای تقسیمی را به ترکیبات یونی نیز بسط داده اند.

به علت اینکه جداسازی در LLC به میزان تقسیم اجزای مخلوط بین دو فاز مایع بستگی دارد این نوع کروماتوگرافی را کروماتوگرافی تقسیمی می نامند.

کروماتوگرافی تبادل یونی:

در کروماتوگرافی تبادل یون از رزین های تبادل کننده ی یون به عنوان فاز ساکن
استفاده می شود. رزین ها, پلیمرهای سنتزی با اتصالات جانبی هستند که پیوندهای کوالانسی و گروههای عاملی یونی شونده می باشند. در رزین های تبادل کنندهکاتیون گروههای آنیونی و در رزین های تبادل کننده آنیون گروههای کاتیونی وجود دارند.

یون مخالف یعنی یون متصل به رزین تقریبا آزاد است و می تواند در فاز متحرک آبی حل شود و درون ستون جریان  یابد.

کروماتوگرافی جذب سطحی:

در روش hplc از سیلیکای اصلاح نشده استفاده می شود. مکانهای جذب روی سطح سلیکا , سیلانول می باشند. در کروماتوگرافی با سیلیکا تعداد نسبی هر نوع از گروههای سیلانول  بستگی به نوع سلیکا و چگونگی تهیه و مراقبت از آنها دارد.

معمولا برای کروماتوگرافی , سیلیکا توسط حرارت دادن در ۱۵۰ تا ۲۰۰ سانتیگراد فعال می شود و سپس توسط فاز متحرک و میزان کمی از آب یا حلال آلی قطبی دیگر به مقدار جزئی غیر فعال شده تا میزان و جذب آن در حد استاندارد گردد.با وجود سیلیکا و فاز متحرک غیر قطبی که با میزان کم حلال قطبی تعدیل شده , لایه ای از مواد قطبی روی سطح سیلیکا جذب می شود.

کروماتوگرافی طردی:

روشی است که مولکولها برمبنای اندازه موثر و شکل آن در محلول از یکدیگر جدا می شوند. و اگر از حلالهای آلی استفاده کنیم این روش اغلب روماتوگرافی ژل تراوا و اگر از حلالهای آبی استفاده نمائیم آن را کروماتوگرافی ژل صافی می نامند. فاز های ساکن مورد استفاده در کروماتوگرافی طرد ذرات متخلخل با اندازه منافذ کنترل شده می باشند. و نباید بین جزء نمونه و سطح فاز ساکن برهم کنش موجود باشد. حجم کل فاز متحرک درون ستون عبارت است از مجموع حجمی که خارج از ذرات فاز ساکن می باشد.

مزایای این روش:

کروماتوگرافی مایع با عملکرد بالا سریعترین رشد را در بین تمام فنون جداسازی تجزیه ای با فروش سالیانه در گستره میلیارد دلار داشته است .

و دلیل این محبوبیت:

۱- حساسیت روش
۲- سازگاری آن برای انجام اندازه گیریهای کمی صحیح
۳- مناسب بودن آن برای جداسازی گونه های نافرار یا ناپایدار گرمایی
۴- کاربرد گسترده آن برای مواد پراهمیت در صنعت
۵- زمینه های مختلف علوم و جامعه

کاربرد های کروماتوگرافی مایع:

*برای مواد حل شده ای که وزن مولکولی بزرگتر از ۱۰۰۰۰ دارند کروماتوگرافی طردی
*برای گونه های یونی با وزن مولکولی پایین کروماتوگرافی تبادل یونی
*گونه های کوچک قطبی اما نایونی از کروماتوگرافی تقسیمی
*و برای جداسازی گونه های ناقطبی , ایزومرهای ساختاری و دسته ترکیباتی از قبیل هیدروکربنهای آلیفاتیک از الکلهای آلیفاتیک از کروماتوگرافی جذب سطحی استفاده می کنند.

اجزاء و قسمتهای مختلف دستگاه HPLC:

۱٫  مخازن حلال:

که در آنها فاز متحرک و یا حلالهای شستشو دهنده ستون ریخته شده است.

۲٫ موتور یا پمپ:

چون ستونها نسبتا طویل و اندازه ذرات کم است. به این جهت قابلیت نفوذ کم می شود و برای این که حلال جریان داشته باشد باید فشاروجود داشته باشد. برای ایجاد فشار از پمپ یا موتور استفاده می کنیم. پمپ فشاری حدود psi 4500 می تواند ایجاد کند. و باید بتواند فشار ثابت ایجاد کند. حلال توسط پمپ با فلوی ثابتی بر روی فاز ثابت حرکت داده می شود. حداکثر فلوئی که فاز متحرک می تواند داشته باشد ml/min 2.5 است. و بسته به نوع کاری که می خواهیم انجام دهیم فلو فرق می کند، هر چه فلو کمتر باشد، فاصله ی پیک ها بیشتر است. چهارمخزن داریم مخزنD, C, B, A میزان فشار بستگی به فلوی ما دارد وقتی فلو ml/min 0.8 است میزان فشار حدود psi 1500 می شود. میزان فشار بستگی به نوع ستون دارد حداکثر فشار مجاز Psi 3500 است. حداکثر تغییرات فشار Psi 100 است. حداکثر فلو ریت Flow rate ، ml/min 2.5 است. پس پمپ، حلال را از مخزن می گیرد و با سرعت گذر ثابتی آن را بداخل دستگاه وارد می کند. در دمای آزمایشگاه کار می کنیم.

به دو روش می توانیم کار کنیم:

* روش ایزوکراتیک isocratic: اگر نسبت های مختلفی از فاز متحرک را در یک مخزن بریزیم و از همان  مخزن فاز متحرک را برداشت کنیم از روش ایزوکراتیک استفاده کرده ایم. مثلا در کار عملی انجام شده درآزمایشگاه فاز متحرک( ۸۰% بافر فسفات ۱۲%  متانل و ۸% استونیتریل) است که پس از صاف کردن همه را در یک مخزن مثل D می ریزیم و از همان مخزن پمپ برداشت  می کند.

* روش گرادیانت gradient :اجزاء فاز متحرک در مخازن مختلف ریخته می شود. دستگاه قابلیت این را دارد که خودش نسبت های مختلف را از مخازن برداشت کند (طبق داده های ما)، مثلا می خواهیم ازمخزن A، ۸۰% از مخزن B 8% و از مخزن C 12% بکشد. و بعد نسبت ها را مخلوط می کند.

از این روش وقتی استفاده می کنیم که نسبت های موردنظر را نمی دانیم و بخواهیم روش کارپیدا کنیم. ولی وقتی درصد فاز متحرک برای ما روشن شد می توانیم از روش ایزوکراتیک استفاده کنیم. فاز متحرک با فلوی ثابتی بر روی ستون حرکت داده می شود حداکثر فلو در این آزمایش ml/min0.8 یا ۱ است. بعد از فعال کردن هر پمپ flow rate را از کم به زیاد کم کم بالا می بریم تا حدود ml/min  ۰٫۸ یا ۱ و می گذاریم حدود یک ربع ساعت یا نیم ساعت با فلوریت بالا کار کند و بعد فلوریت را به تدریج پایین می آوریم تا صفر و بعد پمپ را عوض می کنیم.

یا دستگاه را خاموش می کنیم، فلوریت که بالا برود فشار هم بالا می رود. بعد از اتمام کار ستون را با حلالهای شستشو دهنده می شوئیم.  حلالهای شستشو را در مخازن ریخته و پمپ ها را به ترتیب فعال می کنیم اول دستگاه را با آب و متانل شسته و سپس با متانل خالص می شوئیم. هر پمپ را که فعال کردیم باید ابتداهوا گیری کنیم.

انواع پمپ:

۱- پمپ های پیستونی
۲- پمپهای جابه جایی یا سرنگی
۳- پمپ های فشار ثابت یا بادی

ویژگی سیستم های پمپ کننده:

۱٫تولید فشارهای تا PSi600
۲٫ خروجی بدون تپ
۳٫ سرعت جریان در گستره ۱/۰ تا ml/min10
۴٫کنترل جریان و تکرارپذیری جریان تا ۵/۰% نسبی ویا بهتر
۵٫ اجزای سازنده مقاوم در مقابل خوردگی (فولادهای مختلف زنگ نزن یا تفلون)

۳٫ Injector:

از سرنگهای مختلف با ظرفیت های مختلف استفاده می کنیم. حجم تزریق ۳۰ میکرولیتر است. نمونه ابتدا وارد قسمتی بنام گارد کالوم یا پری کالوم می شود که محافظ ستون است، طول کاردکالوم حدو یک سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضد زنگ است، و ماده پرکننده آن از جنس ماده پرکننده ستون است. اگر ماده ما ناخالصی داشته باشد یا با ماده داخل ستون واکنش ایجاد کند درگاردکالوم انجام می شود و به ستون آسیبی نمی رسد.

۴٫ ستون:

طول ستونهای دستگاه حدود ۳۰-۱۰ سانتی متر است. و جنس آن از فولاد ضدزنگ است. پرمصرف ترین ستون C18 ، ODS آکتا دسیل سیلان است، ستونها را پس از اتمام کار باید با محلولهای شستشو دهنده شست. اگر از بافرفسفات استفاده کردیم ستون را با آب و متانل و بعد با متانل خالص شستشو می دهیم. فاز ثابت بصورت ذرات ریزی در داخل ستون قرار گرفته است. که بر اثر چسبیدن و پخش شدن اجزاء نمونه و عبور فاز متحرک جداسازی انجام می شود. نمونه ابتدا وارد گاردکالوم و بعد وارد ستون می شود، گارد کالوم را پس از مدتی باید عوض کرد، ODS اکتا دسیل سیلان گروههای الکیل غیرقطبی زیادی دارد، فاز متحرکی که استفاده می کنیم قطبی است. فاز متحرک و ماده پرکننده ستون از نظر قطبیت باید عکس هم باشند. در HPLC امکان استفاده از فاز نرمال و معکوس هست.

اگر فاز ثابت قطبی و فاز متحرک غیرقطبی باشد سیستم را فاز نرمال و در صورتی که ستون غیرقطبی و حلال قطبی باشد. سیستم را فاز معکوس می گویند. مشتقات آلکیل سیلان و فنیل سیلان ایجاد ستونهای غیر قطبی می کنند و معمولا ستون غیر قطبی و فاز متحرک قطبی است بنابراین از فاز معکوس استفاده می شود. جنس ستونها از فولاد ضدزنگ یا Stainless steel است.

انواع ستون :

ستون های کروماتوگرافی مایع
ستون های تجزیه ای
ستون های محافظ

ستون های کروماتوگرافی مایع:

این نوع ستون ها معمولا از لوله های فولاد زنگ نزن با منفذ یکنواخت ساخته می شوند , گرچه لوله های شیشه ای یا جداره ضخیم نیز گاهی به کار می روند . لوله های شیشه ای با فشارهای کمتر از psi 600    محدود می شوند.

ستون های تجزیه ای:

طول اکثر ستونهای کروماتوگرافی مایع ۱۰ تا ۳۰ سانتیمتر است. معمولا ستونها مستقیم اند و قطر داخلی ستونهای مایع اغلب ۴ تا ۱۰ سانتیمتر است و متداولترین ذرات پرکننده ها ۵ و ۱۰ میکرومتر است. متداولترین ستون در حال کار این روزها , ستونی با طول ۲۵ میکرومتر پرشده است. و این ستونها می توانند ۴۰۰۰۰ تا۶۰۰۰۰ بشقابک در متر دارد.

ستون های محافظ:

اغلب یک ستون کوتاه محافظ قبل از ستون تجزیه ای به کار می رود تا با حذف نه تنها مواد آلاینده ها از حلالها , بلکه همچنین اجزای نمونه که بطور برگشت ناپذیر با فاز ساکن پیوند می دهند,عمر ستون تجزیه ای را افزایش دهد. همچنین در این روش ستون محافظ برای سیر کردن فاز متحرک با فاز ساکن به کار می رود تا اتلاف این حلال در ستون تجزیه ای را به حداقل برساند. اندازه ذرات در ستون بزرگ است تا افت فشار را به حداقل برساند.

انواع پر کننده های ستون:

پرکننده ذرات پوسته دار

پرکننده متخلخل

پرکننده ذرات پوسته دار: از دانه های شیشه ای یا بسپاری نامتخلخل کروی با قطر نوعی از ۳۰ تا ۴۰ میکرومتر تشکیل شده است و جنس لایه متخلخل سیلیس , آلومین و یا یک رزین تبادل یونی روی سطح این دانه ها رسوب داده شده است. ممکن است دانه ها در اثر اعمال شیمیایی دارای سطحی آلی شوند. اخیرا پرکننده های پوسته دار عمدتا در ستون های محافظ و نه برای ستونهای تجزیه ای به کار می روند.

پرکننده متخلخل: این نوع پر کننده ها از ریز ذراتی با قطری در گستره ۳ تا ۱۰ میکرومتر تشکیل میشود برای یک اندازه معین تلاش میشود تا گستره اندازه ذره به حداقل برسد.این ذرات از سیلیس –آلومین و یا رزین تبادل یونی تشکیل شده اند که سیلیسی متداول تر است. ذرات سیلیس از تجمع ذرات سیلیس ریز میکرون در شرایطی سنتز می شوند که به ذرات بزرگتر کاملا یکنواخت منجر شوند.

۵٫ آشکارسازها:

ردیابها باید حساس باشند و اثر مخرب بر روی اجسام نداشته باشند. پاسخ آنها تا حدود وسیعی برای غلظت باید خطی باشد. عامل وجودی آشکارگر در hplc, آشکار کردن فاز متحرکی است که از ستون بیرون می آید. یک سری گسترده از وسایلی که بعضی از آنها پیچیده و حساس هستند به عنوان آشکارگر مورد استفاده قرار می گیرند. آشکار سازها به دو گروه اصلی آشکار سازهای با خاصیت گروهی و آشکارسازهای با خاصیت جسم حل شده طبقه بندی میشوند.

تعریف دو نوع اصلی آشکارساز:

آشکارسازها با خاصیت گروهی : به خاصیت فاز متحرک مانند ضریب شکست ثابت دی الکتریک یا چگالی که با وجود جسم حل شده مدوله میشودجواب میدهند.

آشکارسازها با خاصیت جسم حل شده: به خاصیتی از جسم حل شده مانند جذبUV    – فلوئورسانس یا جریان نفوذ,  که فاز متحرک فاقد آن است جواب میدهد.

مشخصات آشکارساز ایده آل:

علاوه بر اینکه آشکار سازها در این روش نیازی ندارد به گستره ای به آن وسعت از دما جواب بدهد. علاوه براین برای کاهش پهن شدگی منطقه , آشکار ساز HPLC باید حداقل حجم درونی را داشته باشد
حساسیت کافی
پایداری خوب و تکرار پذیر
قابلیت اعتماد بالا و سهولت کاربرد
زمان جواب کوتاه که مستقل از سرعت جریان است.

انواع آشکارساز:

آشکارسازهای جذبی
آشکارسارهای فلورسانسی
آشکارسازهای ضریب شکست
آشکارسازهای الکتروشیمیایی

آشکار ساز های جذبی:

آشکارگرهای جذب UV عمومی ترین آشکارگرHPLC به حساب می آیند. اصول کارکرد آن براین مبناست که فاز متحرک از ستون به درون محفظه ای کوچک جاری میشود.

محفظه در مقابل اشعه uv/visible منتشر شده از دستگاه نورسنج یاطیف سنج قرار میگیرد. این آشکارگرها انتخابگر بوده , فقط میتوانند اجزاء نمونه ای از نور uv را جذب می کنند آشکار سازند. و برای به حداقل رساندن پهن شدگی نواراضافی ستون , حجم چنین سلولی را تا حد امکان کوچک نگه می دارد. بنابراین حجمها به ۱تا ۱۰ میکرو لیتر و طول سلولها به ۲ تا ۱۰میلی لیتر محدود میشوند.

آشکارسازهای فلورسانسی:

بسیاری از مواد میتوانند نورuv را جذب کرده و سپس اشعه ای در طول موج بالاتر پخش کنند. این پخش یا سریعاصورت میگیرد( فلورسانس) یا باکمی تاخیر (فسفرسانس) و معمولا نور جذب شده که دو مرتبه در طول موج بالاتر پخش میشودبسیار کم است. اما برای بعضی مواد این میزان بین ۱/۰ تا۱ می باشد. و این روش برای آشکار شدن این مواد مناسب میباشد . موادی که بطور طبیعی خاصیت فلورسانسی دارند دارای ساختمان حلقوی مزدوج هستند.

آشکار سازهای ضریب شکست:

این آشکارگر برمبنای اختلاف ضریب شکست جزء نمونه خارج شده از ستون
ضریب شکست فاز متحرک خالص ( به عنوان شاهد) بنا نهاده شده است. تا زمانی که مابین جزء نمونه و فاز متحرک اختلاف شکست نور موجود باشد میتوان گفت که این آشکارگرها نزدیکترین وسیله در HPLC به عنوان آشکارگر جامع می باشند.

آشکارگرهای الکتروشیمیایی:

آشکارگرهای الکتروشیمیایی , هدایت مواد شسته شده را اندازه می گیرند و یا جریان بوجود آمده توسط اکسایش و احیاء جزء نمونه را تعیین می کنند در حالت اول جزء نمونه باید یونی باشد و در حالت دوم جزء نمونه باید براحتی اکسید یا احیاء گردد. نوع اول را آشکارگرهای سنجش رسانایی ویژه گویند .

۶٫ ثبات (رکوردر):

در اثر حرکات قلم پیک هائی رسم می شود که به  مجموعه آنها کروماتوگرام می گویند.به طریق کیفی پیک ها را براساس زمان باز داری یا نگهداری یا Retention time می شناسند. زمان بازداری فاصله زمانی از لحظه تزریق تا رسیدن به نقطه اوج یک پیک است.

برای محاسبه کمی سطح هر نوار جذبی را حساب می کنیم، سطح هر نوار جذبی متناسب با مقدار جسم است که بوسیله انتگراتور یا سطح سنج با دستگاه ثبات بدست می آید سطح هر نوار جذبی یعنی حاصلضرب قاعده × نصف ارتفاع است. روش بریدن نوار و وزن کردن آنها روش قدیمی است. ولی امروزه توسط سطح سنج یا انتگراتور بدست می آید خود دستگاه AUC را مشخص می کند. می توان از ارتفاع هم استفاده کرد و نسبت ارتفاع ها را مشخص کنیم AUC و ارتفاع با یک دستور ساده قابل تبدیل بهم هستند. روش رسم منحنی را انجام می دهیم. در محور افقی غلظت ها و در محور عمودی AUC . بعد از رسم منحنی استاندارد، غلظت مجهول را از روی رسم منحنی بدست می آوریم.

تفاوت HPLC با  GC:

۱٫چون اغلب مواد آلی ناپایدار و کم فرار هستند. برای کار با GC باید آنها را به مشتقات فرار تبدیل کرد که ایجاد مشتقات فرار و باقی ماندن جزئی از مصرف مشتق ساز ایجاد پیک هائی می کند که نتایج آزمایش را مختل می سازد حال آنکه جداسازی این گونه مواد با HPLC به آسانی امکان پذیر است.

۲٫ دو فاز ثابت و متحرک در HPLC بطور رقابتی عمل می کنند و جداسازی بوسیله دو فاز انجام می شود در صورتی که در GC یک فاز یعنی فاز ثابت عمل جداسازی را انجام می دهد.

۳٫ یکی از مزایای HPLC وجود دتکتورهای آنست که برای هر دسته از ترکیبات دتکتورهای انتخابی ویژه وجود دارد که این تنوع دتکتورها از مزایای HPLC است. در صورتی که در GC دتکتور ها محدود تر می باشد.

۴٫ مدت آنالیز در HPLC فوق العاده اندک است، آنالیز ترکیبات آلی ناپایدار و کم فرار مواد خوراکی، شیمیایی داروئی توسط HPLC امکان پذیر است.

۵٫  مواد بسیار قطبی را با GC نمی توان آنالیز کرد در صورتی که با HPLC می شود.

۶٫  در HPLC به سبب دو فاز رقابتی پیک ها معمولا بصورت متقارن هستند در صورتی که در GC اغلب پیک ها بصورت نامتقارن هستند و محاسبه مساحت زیر منحنی یا AUC با اشکال و خطا است. ولی در HPLC بعلت وجود تقارن محاسبه AUC دقیق انجام می شود.

۷٫ وجود آب در نمونه های آزمایش در HPLC اشکال ایجاد نمی کند در صورتی که در GC وجود اندک آب سبب تخریب دتکتور می شود.

۸٫ وجود آب در شبکه کریستالی، وجود مولکولهای آب ئیدروژن در HPLC قابل تشخیص ولی در GC قابل ارزیابی نیست.

۹٫ وجود ناخالص ها بخصوص ناخالصی های بسیار قطبی و یا با وزن مولکولی بالا در HPLC قابل تشخیص ولی در GC قابل تشخیص نیست.

منابع:

http://WebShimi.ir

http://daneshnameh.roshd.ir

http://starbiotech.blogfa.com

http://www.nano.ir

گردآورنده: سیمین سکاکی